神経共培養

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神経共培養は、神経細胞と異種細胞が共培養された細胞培養です。In vivo では、様々な神経細胞や異種細胞が混在し相互作用していますが、神経共培養は比較的これらに近い環境を再現し、改変の検証などにも有用です。

アストロサイトなどグリア細胞は、神経細胞をサポートする役割を担い、神経細胞の正常な機能に不可欠です。また、ミクログリアは中枢神経内の免疫反応をサポートし、アルツハイマーなど神経変性疾患に関与します。これらのグリア細胞は活動電位を発生させませんが、脳の機能に大きな影響を及ぼします。

 

神経細胞の活動パターン -脳領域による差異の検証-

神経・グリア細胞サブタイプの構成は、脳領域ごとに異なります。各領域から検出される電気的な活動の違いから、構成の差異による影響を見ることができます。

本事例では、Maestro MEA を用いて、脳領域毎の神経細胞の電気的活動の違いを検証しました。マウスの脳領域毎に初代神経細胞培養を作成し、培養開始から4週間後に細胞外電位を測定したところ、各培養神経細胞からは異なるスパイクパターンが得られました。

 

Network spike train patterns of brain-region specific primary cell cultures from embryonic murine tissue
Neuro activity characterization of brain region in neural culture
Network spike train patterns of midbrain and frontal cortex specific primary cell cultures from embryonic murine tissue

マウス胚芽組織の各領域 (前頭葉、海馬、中脳、脊髄 (DRG neuron)、視床、中脳+前頭葉共培養 )から分散培養を作成し、培養28日目に細胞外電位を測定した。図は60秒間の細胞外電位測定で検出されたスパイクのラスタープロットを示す。各領域ごとに特徴的なスパイクパターンが見られた。

データ提供 : Neuroproof GMBH, (Voss et al. 2014 presented at SfN2014)

 

神経共培養内における興奮性・抑制性神経細胞の相互作用の検証

神経回路の活動は興奮性神経と抑制性神経の交互作用により特徴づけられます。脳の同期域は、異なるニューロンサブタイプの構成を有し、それぞれに特徴的なネットワーク活動が見られます。

iPS細胞技術により、神経共培養内のニューロンサブタイプの構成を調整することが可能です。本事例ではグルタミン酸作動性興奮性ニューロンとGABA作動性抑制性ニューロンを、異なる割合で2週間共培養しました。GABA作動性ニューロンの割合が高い共培養は、その活動は約2週間でピークに達したものの、ネットワークとしての活動はあまり見られず、培養内を支配する抑制性ニューロンがバーストの同期を妨げることが示唆されました。Network bursting は、同条件でグルタミン酸作動性ニューロンの活動が増した際に多く見られました。アストロサイトを配合し、52 / 22/ 26% (グルタミン酸作動性ニューロン / GABA作動性ニューロン / アストロサイト)割合の共培養から、ラット皮質細胞に近い活動パターンが得られました。

Neural activity raster plot of neural co-culture
Firing rate of neural co-culture over 4 weeks

(左図) 異なる割合の、グルタミン酸作動性ニューロン、GABA作動性ニューロン、アストロサイト共培養から得られたラスタープロット。

(右図) 各共培養の発火頻度 (培養開始から4週間後)。

データ提供 : Neucyte

 

炎症・疾患におけるアストロサイトとミクログリアの役割の検証

グリア細胞は脳内の細胞構成の大部分を占めています。神経細胞をサポートする重要な役割を担い、その構成は多岐に渡ります。アストロサイトなどのグリア細胞は活動電位を持たない持たない一方で、その機能は正常な神経ネットワークの形成と発達において大変重要です。

本事例では、iPS細胞由来神経細胞のみの構成とグリア細胞との共培養の比較検証を行いました。アストロサイトと共培養されたグルタミン酸作動性神経細胞は、神経細胞のみの培養と比較して、Network bursting が40%上昇しました(n=10)。また、Picrotoxin (100 nM) 投与時、その差異は84%に上昇しました。アストロサイトのみの培養からは電気的な活動は検出されず(データ非表示)、Network bursting の増加はアストロサイトの活動電位に拠るものではなく、グルタミン酸作動性神経細胞へのサポートによることが示唆されました。

 

Neural co-culture raster plot from MEA system
Neural co-culture activity in raster plot from Maestro MEA
Neural co-culture activity compared over time

(A) グルタミン酸作動性神経細胞の培養から得られたラスタープロット。

(B) グルタミン酸作動性神経細胞とアストロサイト共培養から得られたラスタープロット。

(C) Picrotoxin (100nM) 投与時の両培養条件下における Network burst 頻度。

 

Maestro Proによる神経共培養と細胞間相互作用の検証

  • 神経細胞培養内の細胞(サブタイプ)組成の違いに拠る活動の変化の検証が可能です。より in vivo に近い環境が再現できます。
  • マルチウェルフォーマットのMEAを使用して、一枚のプレート上に最大96の異なる培養を作成し、その変化を検証することが可能です。
  • 特定サブタイプの検証には光刺激装置 Lumos が有用です。また、Ibidi well insert により、同一well内に2種の培養を作成することも可能です。

 

Neural co-culture assay protocol

Maestro Pro/Edge によるアッセイは非常に簡単です。

事前コーティングされたMEAプレート上に直接神細胞を培養します (Day 0)。Maestro MEA 装置上の温度・CO₂ 濃度を作動させ、MEAプレートを搭載し、ラベルフリーで測定を行います。測定後は付属のソフトウエアで解析します。

注意 : グリア細胞は急激に増殖します。データ測定時にグリア細胞が培養内を支配することがないよう、培養開始時は、比較的薄い密度で播種することを推奨します。

 

 

multiwell microelectrode array (MEA) system in lab

 

Maestro Pro/Edgeによる神経共培養からの測定:特徴

  • ラベルフリー・リアルルタイムで細胞の電気的な活動を測定 - プレート底面の電極を用いて神経細胞の電気的な活動を検出します。ラベルフリー、リアルタイムな測定は、試薬など2次的要因によるゆがみがなく、細胞の状態をより正確にとらえます。

  • 神経細胞ネットワークの検出 – 複数の電極で同時に電気的活動を検出します。神経細胞の個々の活動のみならず、培養内に形成された細胞間ネットワークの活動を検出することができます。一度の測定で多くの情報が得られます。

  • 同一プレート上で培養から測定まで - MEAプレート上で細胞を培養し、細胞外電位を測定します。環境要因による変化を最小限にとどめながら、細胞への負担が少ない状態で、経時的な変化を検出することができます。

  • 簡単操作 - 電気生理未経験の方でも簡単にアッセイが行えます。MEAプレート上に細胞を培養し、装置に搭載するだけで、神経細胞の電気的な活動の測定が可能です。付属のソフトウエアパッケージで、測定、解析から論文などに必要な作表まで行うことができます。

Neural MEA technology

Neural MEA

 

What is a microelectrode array (MEA)?

Microelectrode arrays (MEA), also known as multielectrode arrays, contain a grid of tightly spaced electrodes embedded in the culture surface of the well. Electrically active cells, such as neurons, are plated and cultured over the electrodes. When neurons fire action potentials, the electrodes measure the extracellular voltage on a microsecond timescale. As the neurons attach and network with one another, an MEA can simultaneously sample from many locations across the culture to detect propagation and synchronization of neural activity across the cell network.

That’s it, an electrode and your cells. Since the electrodes are extracellular, the recording is noninvasive and does not alter the electrophysiology of the cells - you can measure the activity of your culture for minutes, days, or even months!

 


Watch the full video and discover if an MEA assay is right for your research.
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An MEA of 64 electrodes embedded in the substate at the bottom of a well.

Rendering of cells growing over the electrodes at the bottom of the well

Neurons attach to the array and form a network. The microelectrodes detect the action potentials fired as well as their propagation across the network.

 

 

 

Brain waves in a dish

Neurons communicate with other cells via electrochemical signals. Many neural cell types form cellular networks, and MEAs allow us to capture and record the electrical activity that propagates through these networks.

Neurons fire action potentials that are detected by adjacent electrodes as extracellular spikes. As the network matures, neurons often synchronize their electrical activity and may exhibit network bursts, where neurons repeatedly fire groups of spikes over a short period of time.

The MEA detects each cell's activity, as well as the propagation of the activity across the network, with spatial and temporal precision. Patterns as complex as EEG-like waveforms, or "brain waves in a dish", can be observed. Axion's MEA assay captures key features of neural network behavior as functional endpoints - activity, synchrony, and network oscillations.

Action potentials recorded from electrodes

Action potentials are the defining feature of neuron function. High values indicate frequent action potential firing and low values indicate the neurons may have impaired function.

Synchrony reflects the prevalence and strength of synaptic connections, and thus how likely neurons are to generate action potentials simultaneously

Synapses are functional connections between neurons. Synchrony reflects the prevalence and strength of synaptic connections, and thus how likely neurons are to generate action potentials simultaneously on millisecond time scales.

Network oscillations, or network bursting, are defined by alternating periods of high and low activity

Network oscillations, or network bursting, as defined by alternating periods of high and low activity, are a hallmark of functional networks with excitatory and inhibitory neurons. Oscillation is a measure of how the spikes from all of the neurons are organized in time.

 

Do more with multiwell

Axion BioSystems offers multiwell plates, ranging from 6 to 96 wells, with an MEA embedded in the bottom of each well. Multiwell MEA plates allow you to study complex neural biology in a dish, from a single cell firing to network activity, across many conditions and cell types at once.